Icoana Fecioarei Maria se află în iconostasul Capelei Imnului Acatist, atașată în partea stângă a bisericii principale. Icoana este realizată din ceară și mastic și, potrivit tradiției, aparține chiar mâinii Apostolului Luca. A fost purtată în procesiune, împreună cu alte sfințenii, în jurul zidurilor Constantinopolului de către Patriarhul Serghie în timpul asediului din 624, când împăratul Heraclius era absent într-o campanie militară împotriva perșilor. Flota inamică a fost distrusă de o furtună pe mare, iar orașul a fost salvat prin grija Maicii Domnului; credincioșii au făcut o veghe de o noapte întreagă, în timpul căreia patriarhul a cântat un acatist. Împăratul Alexius al III-lea Comnenus a oferit icoana în dar fondatorului mănăstirii Dionisiu, la întâlnirea lor din Trapezunt în 1374. Icoana a fost numită Izvorâtoare de Mir, deoarece uneori emană mir, ale cărui urme sunt diferite pe suprafața sa.
În timpul unui raid al piraților din 1592, icoana Fecioarei Maria, împreună cu alte sfințenii, a fost furată din mănăstire. Cu toate acestea, o furtună fără precedent a izbucnit pe mare și imediat Fecioara Maria i-a apărut liderului piraților și a anunțat că icoana trebuie returnată imediat mănăstirii. Când a deschis cufărul în care se afla icoana, a descoperit că aceasta era acoperită cu mir. Pirații, îngroziți, au returnat icoana la mănăstirea Dionisiu, în timp ce doi dintre ei au rămas la mănăstire și au depus jurământul monahal.
În 1758, arhimandritul Eugene Voulgaris, profesor la Academia Athos, a fost vindecat de o boală cumplită de această icoană. În 1767, icoana a fost furată a doua oară de necreștini, dar creștinii au reușit să o recupereze și să o transporte pe insula Skopelos. La început, locuitorii insulei nu au fost dispuși să înapoieze icoana reprezentanților mănăstirii care au venit să o ia. Cu toate acestea, au fost nevoiți să facă acest lucru deoarece pe insulă a izbucnit o epidemie.
În timpul marilor sărbători, icoana este purtată în procesiune de la Capela Imnului Acatist până la biserica principală a mănăstirii prin sunetul clopotelor. În timp ce preoții poartă icoana, călugării cântă "Vrednică Ești". În biserica principală, icoana este așezată pe un tron special, unde rămâne pentru venerare în timpul sâmbetei din săptămâna a 5-a din Postul Mare, în care cade sărbătoarea Maicii Domnului, precum și în timpul sărbătorii Săptămânii Luminate și în ajunul Crăciunului și în ziua de sărbătoare a mănăstirii însăși.
În fiecare zi, în Capela Imnului Acatist a Maicii Domnului se săvârșește Sfânta Liturghie și se cântă un canon de rugăminte.
Cântarea Sfintei Fecioare Maria - este un imn cunoscut de toți cu tema principală a întrupării umane a Divinității prin Maica Domnului. Acest imn este un tip de poezie ecleziastică care a devenit deosebit de popular în sec. al V-lea și al VI-lea. Autorul acestui imn rămâne necunoscut.
Imnul este structurat în 24 de strofe, în funcție de numărul de litere din alfabetul grecesc; fiecare strofă începe cu litera corespunzătoare, de la Alfa la Omega. Celelalte strofe încep cu cuvântul "Bucurați-vă".
Acest imn este unul dintre cele mai frumoase exemple de poezie bizantină. El a inspirat nu numai scrierea de noi imnuri, ci și pictura de icoane și fresce care înfățișează cele 24 de strofe. Acest imn îi ajută întotdeauna pe cei care suferă - nu numai în viața de zi cu zi, ci și în ceasul dinaintea morții, așa cum se vede în viețile diferiților sfinți.
Din păcate, icoana Maicii Domnului Imnul Acatist este deteriorată în multe locuri din cauza efuziunii mirului; figurile Maicii Domnului și ale lui Hristos sunt aproape imposibil de distins.
Maica Domnului de la Mănăstirea Dionisiu este înfățișată într-o îmbrățișare tandră cu Pruncul Iisus și aparține tipului de iconografie a Maicii Domnului Umilință, cunoscută încă din perioada bizantină medievală.
Icoana este acoperită din ambele părți cu o ramă, creată în 1786 pe cheltuiala Mitropolitului Ieremia de Belgrad. Pe avers, în partea de jos a ramei de argint și aurire, se află inscripția "Rugăciunea slujitorului lui Dumnezeu, Arhiepiscopul Ieremia, 1786, 20 mai". Pe reversul ramei de argint se află înmânarea icoanei de către împăratul Imperiului Trapezuntului, Alexie al III-lea Komnionul cel Mare, către întemeietorul mănăstirii Dionisiu. Această scenă este însoțită de o inscripție care descrie istoria icoanei. Deasupra capului împăratului se citește: "Alexius Regele Comnenus cel Mare", deasupra fondatorului mănăstirii: "Sfântul Dionisie din Athos".
În secolul al XVIII-lea, icoana mănăstirii Dionisiu a fost încrustată cu o altă icoană reprezentând 24 de strofe ale acatistului. Această parte este, de asemenea, decorată cu o ramă de argint și aur, creată de călugărul Iosif Neoskitiotis în 1930, când arhimandritul Marcu era egumen.
Practica de a încrusta o icoană în alta este cunoscută încă din perioada Paleologilor (secolul al XIII-lea) și se datorează dorinței de a concentra atenția asupra unei icoane deosebit de venerate. În cazul mănăstirii Dionisiu, această incrustare rezultă din dorința de a însoți icoana Maicii Domnului cu 24 de strofe ale acatistului. Un exemplu similar este icoana din iconostasul Bisericii Adormirii Maicii Domnului de pe insula Milos, care păstrează o astfel de icoană "încrustată" a Maicii Domnului. Pe această ramă din sec. al XVII-lea, ca și în cazul icoanei de la mănăstirea Dionisiu, au fost așezate strofe ale acatistului, profeții cu pergamente și simboluri referitoare la Maica Domnului.
