Икона Богородицы находится в иконостасе часовни Акафистной, пристроенной в левой стороне главного храма. Сделана эта икона из воска и мастики и, согласно преданию, принадлежит руке самого апостола Луки. Она была пронесена крестным ходом вместе с другими святынями Патриархом Сергием вокруг стен Константинополя во время его осады в 624 году, когда император Ираклий отсутствовал в военном походе против персов. Вражеский флот был разрушен морским штормом, и город был спасён заботами Богородицы; верующие совершили всенощное бдение, во время которого патриарх пел Акафист. Император Алексей III Великий Комнин передал икону в дар основателю монастыря Дионисиат во время их встречи в Трапезунде в 1374 году. Икона была названа мироточивой, так как иногда источает миро, следы которого различимы на ее поверхности.
Во время пиратского набега 1592 года икона Богородицы вместе с другими святынями была выкрана из монастыря. Однако на море поднялся небывалый шторм, и тут же Богородица явилась предводителю пиратов и возвестила, что икона должна быть немедленно возвращена в монастырь. Когда он открыл сундук, в котором находилась икона, то обнаружил, что она вся была покрыта миро. Объятые ужасом пираты возвратили образ в Дионисиат, а двое из них остались при монастыре и приняли монашеский постриг.
В 1758 году преподаватель Афонской Академии архимандрит Евгений Вулгарис был излечен этой иконой от страшной болезни. В 1767 году образ был украден иноверцами во второй раз, но христиане смогли вернуть его и перевезти на остров Скопелос. Сначала жители острова не пожелали вернуть икону представителям монастыря, пришедшим, чтобы ее забрать. Тем не менее, они были вынуждены это сделать, так как на острове началась эпидемия.
Во время великих праздников икона проносится крестным ходом из часовни Акафистной в главный храм монастыря под колокольный звон. В то время как священнослужители несут икону, монахи поют «Достойно Есть». В главном храме икона помещается на специальный трон, где остаётся для поклонения на протяжении субботы 5-ой недели Великого Поста, на которую приходится праздник Богородицы, а также на время празднования Светлой Седмицы, на рождественские Святки и в день празднования самого монастыря.
В часовне Богородицы Акафистной каждый день проходит божественная литургия и поётся просительный канон.
Песнь Пресвятой Богородице — это известный всем гимн с главной темой человеческого воплощения божественного через Божью Матерь. Этот гимн представляет собой тип церковной поэзии, получивший особое распространение в пятом и шестом веке. Автор этого гимна остаётся неизвестным.
По своей структуре гимн состоит из 24 строф, по числу букв в греческом алфавите; каждая строфа начинается с соответствующей буквы от Альфы до Омеги. Другие строфы начинаются со слова "Радуйся".
Этот гимн является одним из лучших примеров Византийской поэзии. Он вдохновил не только на написание новых гимнов, но также на создание икон и фресок, запечатлевших 24 строфы в живописи. Этот гимн всегда помогает страждущим — не только в повседневной жизни, но и в час перед смертью, как это видно из жития различных святых.
К сожалению, икона Богородицы Акафистной повреждена во многих местах вследствие источаемого мира; фигуры Богородицы и Христа практически неразличимы.
Богородица монастыря Дионисиат изображается в нежном объятии с младенцем Христом и относится к типу иконографии Богородицы Умиление, известному еще со средневизантийского периода.
Икона с двух сторон покрыта окладом, созданным в 1786 году на расходы Митрополита Белграда Иеремии. На лицевой стороне в нижней части серебряного с позолотой оклада читается надпись: "Молитва раба Божьего Иеремии архиерея, 1786 май 20". На обратной стороне серебряного оклада изображается передача иконы императором Трапезунды Алексием III Великим Комнииным основателю монастыря Дионисиат. Эта сцена сопровождается надписью, описывающей историю иконы. Над головой императора читается: "Алексий Царь Великий Комнин", над основателем монастыря: "Святой Дионисий с Афона".
В XVIII веке икона монастыря Дионисиат была инкрустирована в другую икону, на которой изображены 24 строфы Акафиста. Эта часть также украшена окладом из серебра и золота, созданным монахом Иосифом Неоскитиотисом в 1930 году, когда игуменом был архимандрит Марк.
Практика инкрустирования одной иконы в другую хорошо известна начиная с периода эпохи Палеологов (XIII век) и обусловлена желанием сакцентировать внимание на особо почитаемой иконе. В случае монастыря Дионисиат эта инкрустация является следствием желания сопроводить икону Богородицы изображением 24 строф Акафиста. Аналогичным примером является икона с иконостаса храма Успения Богородицы на острове Милос, где хранится такая «инкрустированная» икона Богородицы Умиление. На этой иконе на раме XVII века, также как и в случае иконы монастыря Дионисиат, были помещены строфы Акафиста, пророки со свитками и символы, имеющие отношение к Богородице.